一. 本地blast简介

本地Blast(Basic Local Alignment Search Tool)，是基于本地的比对搜索工具，可以在自己建立的数据库进行blast搜索，与NCBI的在线blast相比，其速度快，搜索范围更小，且在没有互联网的情况下可以进行，比如已知道大麦的一个基因，并已经明确其功能，现在要在大麦中找序列相似度高的基因，就可以在本地建库，即建立大麦的数据库，然后blast找同源序列。

二. 本地blast的安装

1.NCBI下载本地版blast

[下载链接]：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/下载与自己电脑系统相适应的版本，这里我下载ncbi-blast-2.11.0

2.安装本地blast程序

下载后双击安装，可通过比较程序大小判断是否下载完全，生成bin和doc两个子目录，其中其中bin是程序目录，doc是文档目录，也可点开查看程序的完整性，然后在目录下新建文件夹，重命名为db

3.用户环境变量设置

此电脑-属性-高级系统设置-环境变量
在用户变量下方：新建-变量名：balstdb，变量值为电脑安装好新建的db文件夹的路径
在系统变量下方：Path-添加变量值为电脑上bin文件夹位置

三.建立本地blast数据库

1.数据库下载

ensemble等数据库下载大麦的pep数据，并将其解压到db文件夹中

2.数据库格式化

在db文件夹中未选中任何目标的情况下，按住Shift，在文件夹空白处右击鼠标，选择在此处打开PowerShell窗口，打开如图所示窗口。我用的是win10的系统可以通过这种方式快速进入db文件夹的位置，如果是其他版本的windows系统，可能需要通过运行cmd进入db文件夹所在的位置。
attention：文件在当前Windows powershell所打开文件夹下因此不需要代入路径

运行命令：

makeblastdb.exe  -in Hordeum_vulgare.IBSC_v2.pep.all.fa -parse_seqids -hash_index -dbtype prot

其中Hordeum_vulgare.IBSC_v2.pep.all.fa 为你要格式化的数据库的名称，根据你自己的数据库的名称进行改动，记得加上后缀名.fa；dbtype后的prot表示数据库的类型，prot表示氨基酸序列的数据库，如果是核苷酸序列则用nucl。命令行中数据库格式化完成后显示下图

四.本地blast运行

1.query序列的准备

在D:\my software\ncbi-blast-2.11\blast-2.11.0+\db文件夹下创建target.seq.txt的文本文件，将需要查询到的序列以fasta格式保存到in.txt中，我们已1条barley的蛋白序列为例

2.query序列的查询

在D:\my software\ncbi-blast-2.11\blast-2.11.0+\db 文件夹下创建新建文本文件.txt的文本文件，使用blast的命令：

blastp.exe -task blastp -query target.seq.txt -db Hordeum_vulgare.IBSC_v2.pep.all.fa -out out.txt -evalue 1e-10 -outfmt 6 -num_threads 2

相关参数说明：

blastp.exe 程序执行命令，exe 前的程序根据自己的需要而换，包括blastn,blatp,tblastx等bin文件夹中所包含的程序；

-task 后面选择你所要用的程序，blastn,blastp,tblastx 等；

-query 后接查询序列的文件名称；

-db 后接格式化好的数据库名称；

-out 后接要输出的文件名称及格式，格式形式包括0-10，其中6和0最常用，可以自己尝试。

-num_threads 的参数设置可以根据自己电脑的性能进行设置，笔记本推荐不超过2，从而提高比对效率

保存后再将新建文本文件.txt重命名为Hordeum_vulgare.pep-blast.cmd，此时已经将一个文本文件修改为windows中的cmd命令，双击即可运行

blast结果说明

每一列分别表示：
A:Query_id
B:Subject_id
C:Identity
D:Align_length
E:Miss_match
F:Gap
G:Query_start
H:Query_end
I:Subject_start
J:Subject_end
K:E_value
L:Score
E值（Expect)：表示随机匹配的可能性，例如，E=1，表示在目前大小的数据库中，完全由机会搜到对象数的平均值为1.E值越大，随机匹配的可能性也越大。E值接近零或为零时，具本上就是完全匹配了。通常来讲，我们认为E值小于10-5 就是比较可性的S值结果。我们可以想象，相同的数据库，E=0.001时如果有1000条都有机会S值比现在这个要高的话，那么不E设置为10-6时可能就会只得到一条结果，就是S值最可靠的那个。但是E值也不是万能的。它在以下几个情况下有局限性：
1）当目标序列过小时，E值会偏大，因为无法得到较高的S值。
2）当两序列同源性虽然高，但有较大的gap（空隙）时，S值会下降。这个时候gap scores就非常有用。
3）有些序列的非功能区有较低的随机性时，可能会造成两序列较高的同源性。
E值总结：E值适合于有一定长度，而且复杂度不能太低的序列。当E值小于10-5时，表明两序列有较高的同源性，而不是因为计算错误。当E值小于10-6时，表时两序列的同源性非常高，几乎没有必要再做确认。

一致性(Identities)：或相似性。匹配上的碱基数占总序列长的百分数。

Score:得分值越高说明同源性越好；Expect期望值越小比对结果越好，说明因某些原因而引起的误差越小；Identities是同源性（相似性），例中所示比对的1299个碱基中只有35个不配，其他97％相同；

Gaps:是指多出或少的碱基或缺失的碱基数；缺失或插入（Gaps）：插入或缺失。用"—"来表示。
此外比对的Strand则通 s. Start：和s. End判断，如上述结果的第三行. Star值大于s. End，则表示负链。

总结及补充：另外的方法

进行本地blast序列对比我们需要建立一个库文件（在线blast的库使用的是各大生物数据库的文件），输入命令：makeblastdb建库命令。

makeblastdb -in b.fasta -dbtype nucl -out b.fasta.blastdb

makeblastdb -in b.fasta -dbtype nucl -out b.fasta.blastdb[文件在当前Windows powershell所打开文件夹下因此不需要代入路径]
==注意空格不能少=
-in 后面是建库文件，我们使用较大的文件建库
-out 后面跟输出的库文件名，一般在第一步建库之后会生成三个文件nhr/nin/nsq这三个共同作为一个库进入下一步。
如果跑的是核酸序列，使用blastn

blastn -query a.fasta -db b.fasta.blastdb -out b.blast -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 2

blastn -query a.fasta -db b.fasta.blastdb -out b.blast -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 2
-query： 输入文件路径及文件名
-out：输出文件路径及文件名
-db：格式化了的数据库路径及数据库名
-outfmt：输出文件格式，总共有12种格式，6是tabular格式对应BLAST的m8格式
-evalue：设置输出结果的e-value值
-num_descriptions：tabular格式输出结果的条数
-num_threads：线程数[笔记本一般不超过2]

该图为我用蛋白质序列去核酸数据库跑tblastn所运行的命令
最后，附上“参考文献”
参考文章链接：
https://blog.csdn.net/zxpuls123/article/details/81407277
https://blog.csdn.net/qq_43337286/article/details/103120003